根据使用材料的不同进行下列操作:a)对贴壁细胞:吸尽培养液,在每10平方厘米细胞中加入0。8mL预热的溶液A,用枪充分吹打以确保细胞全部裂解,然后把裂解液转移到5mL塑料离心管中。b)对悬浮细胞:离心收集细胞,吸尽液体,在每1-5×106悬浮细胞中加入0!8mL预热的溶液A,用枪充分吹打以确保细胞全部裂解.然后把裂解液转移到5mL塑料离心管中!如果是fibroblasts或carcinoma细胞,0。
它具有下列特点:DNA更加纯净,大多数DNA样品的OD260/280值在8-9之间.DNA产率一般在200ug/g左右(跟组织种类密切相关)。可直接用于PCR、酶切、杂交等后续反应!操作更加简单,离心吸附操作代替离心沉淀,整个过程室温操作约10分钟,适合大规模样品处理!安全无毒,本试剂盒对人体无毒,无腐蚀性和刺激性气味!质量和国外同类产品相当,但价格更便宜.常温运输和保存、有效期一年!注意:溶液A容易产生沉淀,溶液B十分粘稠,用前均需要在65℃水浴中加热使沉淀溶解或粘稠度降低,用前充分摇匀!
加入0。4mL预热的溶液B到裂解液中。由于溶液B十分粘稠,可将1mL枪头剪掉一截再用,也可以用称量方法加0。4g!加入溶液B后需要颠倒数次充分混匀!65℃水浴5-10分钟.如果室温放置,DNA产量将降低10-20%!加入0。2mL自备氯仿,振荡器上充分振荡混均30秒,此时溶液将呈乳白色.一定要确保离心管底的液体被震荡起来!12000-15000g室温离心2分钟!上清透明,中间层为白膜(蛋白层)!小心将上清液平均转移到两个新的离心管中,避免触及中间的白膜!
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每个管中加入5倍体积的溶液C,充分颠倒混匀。分两次上柱(即先转移一半的混合液到离心吸附柱中,室温放置2分钟,12000-15000g室温离心半分钟,弃穿透液,然后再将剩下的混合液到离心吸附柱中,室温放置2分钟,12000-15000g室温离心半分钟,弃穿透液).加0!7mL通用洗柱液到离心吸附柱中,12000-15000g室温离心半分钟,弃穿透液!10!加0!3mL通用洗柱液到离心吸附柱中,12000-15000g室温离心半分钟,弃穿透液.
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1 淋巴细胞的分离(1)取抗凝血5ml,1000~1200r/min离心10min。(2)吸取上层血浆转至新的小管子中,-70℃保存。(3)以等体积的PBS稀释血细胞后加入至4ml淋巴细胞分离液中。(4)室温条件下离心1000~1200r/min25min,吸取中间层白细胞转移到干净离心管中。
(5)加入10ml PBS,混匀,离心,1000~1200r/min,共10min,弃掉上清。重复2次。(6)用1。5ml PBS悬浮白细胞,在4℃条件下,5000rpm10min,放弃上清,沉淀-70℃保存。2 DNA的常规提取白细胞用15ml DNA抽提液悬浮,37℃保温1h,然后按照常规的DNA提取的方法进行提取。
这种DNA的提取方法分淋巴细胞的分离和DNA提取两个步骤。相对而言,耗时多,操作复杂,消费的试剂也较昂贵。3 改进的方法在日常的外周血的收集过程中,我们利用下面的方法 本课题受辽宁省教委科技攻关项目(编号 8)提取DNA:(1)取抗凝血5ml在沉淀中加入15ml PBS,混匀,离心2000r/min10min。
2000r/min离心10min。(2)将血浆转至新的试管中,-70℃保存。(3)将血细胞转入另一支大的试管中(10ml或50ml)加入尽可能多的冷的蒸馏水混匀。(4)将其插入冰内5~10min或放入-20℃15min。(5)将上述混合液从冰中或-20℃取出放至室温,离心2000r/min20min。
(6)弃上清,收集沉淀。(7)在沉淀中加入15ml PBS,混匀,离心2000r/min10min。此步骤重复3次至沉淀为淡红色或白色。(8)将沉淀转入小管,加少量PBS,每分钟5000r/min离心5min,去上清。(9)沉淀-70℃保存。
通过比较我们会发现这种方法不用进行淋巴细胞的分离,直接提取DNA,不仅节省了实验时间,而且节省了淋巴细胞分离液、蛋白酶K和RNase等多种试剂,更重要的是DNA的质量完全可以满足PCR的要求,是一种简便快捷的实验方法。 参考文献1 卢圣栋。
现代分子生物学实验技术,第2版。北京:中国协和医科大学出版社,1999。2 Zhang J,Zheng S,Gao Y,et al。Apartial allelotyping of urothelial carcinoma of bladder in the Chinese。
Carcinogenesis,2003,6:58。3 Zhang J,Fan Z,Gao Y,et al。Detecting bladder cancer in the Chinese by microsatellite analysis:ethnic and etiologic considerations。
J Natl Cancer Inst,2001,Jan3:93(1):45-50。 作者单位:116027大连医科大学组织学与胚胎学教研室 116000大连医科大学*附属医院胸外科。