菌种筛选

TJ-MiniPod平行筛选发酵系统特别适合于各种微生物和基因工程菌的菌种筛选和培养的早期大批量工作，高通量筛选能力明显优于常规的摇床和生物反应器。传统的菌种初筛和复筛都是在没有任何检测参数的摇瓶或试管中进行的，筛选过程微生物的外在培养环境与工业发酵生产存在巨大反差，很多真正符合实际生产环境、性状优良的菌种往往在筛选初期就被漏筛掉了。TJ-minipod系列模块化迷你平行发酵系统解决了这个问题。可以通过该装置pH检测功能，根据发酵过程参数相关的原理观察到菌体生理特性的变化。带pH测量的平行筛选微型发酵罐既克服摇瓶中多参数测量的困难，又不失为代谢流分析的基本原理。微量补料技术，实现各种碳氮源的流加、pH控制或微量元素控制等。把pH实时测量与流加技术相结合，对实现以代谢流为核心的动态研究具有重要意义。用户可根据工艺需要,随意搭建模块化的高通量筛选平台，以最低的成本实现在线数据过程控制。菌体生长过程pH的变化规律，接种量与移种时机的研究基础培养基的优化菌体生长阶段和产素阶段最适pH的研究流加补料的研究，包括补料种类、速率及动力学研究可实现代谢流为核心的动态研究。全容量500ml/1L可选径高比1：2；装液系数60~80%罐体材质全硼硅玻璃，且做除静电处理罐盖结构全玻璃罐体、罐内无死角，带深层通气空气管和气体分布环表面处理内外表面镜面抛光，抛光精度Ra0.4；所有焊缝整齐美观不打磨（按照国际标准）pH控制系统控制范围：2.00-12.00；控制精度：±0.02温度控制15℃~40℃；精度±0.2℃通气控制范围：0.3~420mL/hr超微量补料控制范围：0.2ml~200ml/min；精度：±0.02ml搅拌控制50~800rpm2.3地衣芽孢杆菌的基因敲除地衣芽孢杆菌基因敲除的方法在我们过去的论文中有描述（Caietal.,2016）。在这里，以构建cydB缺陷菌株为例。简言之，以地衣芽孢杆菌WX‐02基因组DNA为模板，采用引物cydB‐KF1/R1和cydB‐KF2/R2扩增得到cydB基因的上游和下游同源臂，经重叠扩展(SOE)‐PCR得到融合片段。融合片段入到限制酶位点XbaI/SacI酶切后的T2(2)‐Ori中。菌落PCR和DNA测序证实重组质粒(T2‐cydB)构建成功。将重组质粒T2‐cydB电转化至WX‐02，通过菌落PCR和质粒抽提证实转化成功。阳性转化子首先在含20mg/L卡那霉素的LB培养基中，45℃条件下培养促进单交换发生，然后在无卡那霉素培养基中37℃培养。卡那霉素敏感菌落经菌落PCR验证，获得双交换转化株。这个突变株经DNA测序后证实，并命名为WXΔcydB。其他的基因（ythA,ctaC,qoxA,cydC,narG,nasC,resD）的敲除采用相同的方法。2.4基因表达载体的构建基因表达载体的额构建参照之前发表的方法(Caietal.,2016),我们以narG过表达载体的构建举例。简言之，采用引物分别扩增枯草芽孢杆菌P43启动子，编码呼吸型硝酸还原酶基因narG，淀粉酶终止子序列amyL，并用SOE-PCR将三个片段融合到一起。融合的片段插入至限制性内切酶EcoRI/XbaI切后的PHY300PLK。菌落PCR和DNA序列证实重组质粒(pHY-narG)构建成功。采用相同的方法构建了其他基因（vgB,purB,adK,nasC,andresD)）的表达载体。2.5地衣芽孢杆菌中基因整合为了构建同时过表达vgb,adK,和resD基因的菌株，按照之前发表的方法将P43启动子介导的单个基因整合到地衣芽孢杆菌的染色体中(Cai,Wang,etal.,2017).通过菌落PCR和DNA测序对重组菌株进行验证2.6测定细胞生物量，γ-PGA产量和葡萄糖细胞生物量通过细胞干重来测量。γ-PGA浓度通过高效液相色谱参照之前描述的方法完成(Wang,Yuan,Wei,Chen,Chen,2015).葡萄糖浓度通过SBA-40C生物分析仪测定（中科院，山东）。

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