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生物反应器放大

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江南大学生物系统与生物加工过程研究室提供在线搅拌釜反应器放大计算、反应器在线放大计算、CFD流场模拟。数字孪生、数字双胞胎搅拌釜反应器放大设计、搅拌釜反应器计算流体力学模拟、反应器放大设计、液-固相搅拌釜反应器的放大研究、反应器在线放大计算、CFD流场模拟迪必尔生物提供免费的生物反应器放大scale-up和缩小scale-down模型在线计算网站,结合传质、CFD流场模拟、反应动力学基础理论研究。实现传质系数,剪切速率,二氧化碳分压,溶氧浓度,混合时间等关键工艺参数在不同规模生物反应器之间进行转换"多联小型平行发酵系统基础上,构建一个人工神经网络1和2,1的输入端为反应器全部的操作参数,如搅拌、气速、补料流量、发酵时间等,输出端为表征发酵效果的参数,如产量、浓度、转化率、发酵强度、能耗,等。发酵过程中,1实时对发酵过程进行学习,预测发酵效果。2使用1的一个实时副本,通过调整其输入值得到一个最优的操作条件组合,并反馈给反应器的控制系统。操作条件改变后的发酵数据再次进入1,如此循环往复,实现发酵工艺的自动优化。使用上述神经网络的一个实时副本(即虚拟发酵系统,或称数字孪生)和一套优化算法,计算最优操作条件并实时反馈给PLC进行测试。测试结果再次返回首个神经网络进行迭代优化。以上两步由软件控制、24小时不间断连续反复进行(即机器学习的过程)。不同培养基成分对发酵有着错综复杂的交互影响。这种影响很难用直白的机理模型来模拟,因为变化太多2、神经网络就是不考虑机理,但是做大量的实验,然后拟合出一个模型来,能表征这些相互影响3、如果用神经网络拟合了有限的实验数据之后,就可以任意调整培养基成分,然后从中找到最优的组合"1毕赤酵母表达系统1.1毕赤酵母表达系统概述毕赤酵母表达系统是近年来发展迅速的一个真核表达系统,对于异源表达有许多优点:①其分子遗传操作简单;②AOXI启动子具有很强的诱导启动特性,适合多种外源基因的高效表达;③重组毕赤酵母从摇瓶水平发酵扩大到细胞高密度发酵非常容易,外源基因的表达水平因此得到很大的提高,利于工业化生产;④外源蛋白的积累不会毒害酵母细胞;⑤毕赤酵母自身分泌蛋白少,简便纯化工艺;⑥外源基因重组在染色体实现一起复制和同步遗传,外源基因不易丢失。基于以上,毕赤酵母得以在高密度发酵发挥其巨大潜力。1.2常用表达菌株及表达载体1.2.1表达菌株目前,用于外源基因表达的P.pastoris菌株为Invitrogen公司构建,主要有:Y-11430、M-G100-3、GS115、KM71和SMD1168。其中Y-11430为野生型,其余皆为组氨酸突变型。GS115有完整的AOXⅠ基因,在甲醇培养基上表型为Mut+,当用重组表达载体转化后,因为表达载体线化所用酶不同,其转化子表型可能是Mut+或者Muts,可通过MD和MM培养基进行表型的鉴定;KM71的AOXⅠ基因被ARG4替代,虽然AOXⅠ和AOXⅡ有97%同源性,但AOXⅡ利用甲醇的能力远比AOXⅠ弱,在甲醇培养基上表现为Muts,其转化子也是Muts,表型不必鉴定。SMD1168为蛋白酶缺陷型菌株,特别适用于分泌表达载体,可避免表达外源蛋白被宿主菌同时表达的蛋白酶所降解。1.2.2表达载体P.pastoris没有稳定的附加体质粒,所以一般用整合型载体作为外源基因的表达载体。P.pastoris既有分泌表达型的,又有胞内表达型的,常用的表达载体主要:pPIC9、pPIC9K、pHILS、pAO815、pHIL-D2和pPICz等,其中pPIC9K和pHIL-S为分泌型表达载体,而pAO815、pHIL-D2和pPICz为胞内型表达载体。多数P.pastoris表达载体还含有HIS4基因,它可以作为转化体的选择标记,同时还含有在细菌中复制所必须的序列及一些选择标记,如大肠埃希氏菌的复制起始点和Amp抗性基因等;还有一些载体含有来自于AOXⅠ基因的3’端侧翼序列,可以用来指导含外源基因的组件插入3’AOXⅠ基因位点或者以基因整合的方式整合到酵母染色体的AOXⅠ位点。一般情况下,整合到酵母染色体上的基因拷贝数越多,蛋白表达量就越高。多拷贝发生在AOXⅠ或者组氨酸基因位点,但同一位点同时插入多个基因的几率仅占His+转化体的1%-10%,为此,人们根据不同表达载体的组成特点,如pPIC3K和pPIC9K含有kanr抗性基因;pPICz系列含有bler基因,利用基因剂量效应,分别依靠G418R或者ZeocinR的抗性水平来快速筛选除高拷贝的整合转化子。对于PAO815,一般通过多拷贝表达盒BamHI-BglII串联而先在体外用人工方法构建好多拷贝载体,然后转化到宿主菌中获得多拷贝转化子。

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