8mL溶液A的细胞使用量不要超过1×106个细胞。c)对新鲜或冷冻的组织:先将剪切成小块的新鲜组织或冷冻保存的组织放入10mL或15mL塑料离心管中,每50-100mg组织加0。8mL预热的溶液A,用剪切式匀浆器匀浆30秒左右,然后把裂解液转移到5mL塑料离心管中!对肝、脾、胰、肾等细胞分裂十分旺盛的组织(细胞中含大量正在复制的DNA),建议组织的使用量不要超过50mg。对DNALOCKER保存组织:先用纸吸去DNALOCKER液体后再剪切成小块,其余操作同新鲜或冷冻组织的处理。
加入0.4mL预热的溶液B到裂解液中。由于溶液B十分粘稠,可将1mL枪头剪掉一截再用,也可以用称量方法加0.4g。加入溶液B后需要颠倒数次充分混匀!65℃水浴5-10分钟!如果室温放置,DNA产量将降低10-20%!加入0。2mL自备氯仿,振荡器上充分振荡混均30秒,此时溶液将呈乳白色.一定要确保离心管底的液体被震荡起来!12000-15000g室温离心2分钟.上清透明,中间层为白膜(蛋白层)!小心将上清液平均转移到两个新的离心管中,避免触及中间的白膜!
112000-15000g室温再离心半分钟!此步十分重要,否则残留的通用洗柱液会污染DNA!1室温放置半分钟使残留乙醇挥发!1将离心吸附柱转移到一新的5mL塑料离心管中,加入50-100uLDNA洗脱液0,室温放置离心吸附柱1-2分钟!112000-15000g室温离心半分钟,离心管中溶液即为DNA样品,可以立即使用或存放于冰箱待用!动物DNA提取试剂盒(吸附柱法)对DNALOCKER保存组织:先用纸吸去DNALOCKER液体后再剪切成小块,其余操作同新鲜或冷冻组织的处理。
每个管中加入5倍体积的溶液C,充分颠倒混匀!分两次上柱(即先转移一半的混合液到离心吸附柱中,室温放置2分钟,12000-15000g室温离心半分钟,弃穿透液,然后再将剩下的混合液到离心吸附柱中,室温放置2分钟,12000-15000g室温离心半分钟,弃穿透液)!加0.7mL通用洗柱液到离心吸附柱中,12000-15000g室温离心半分钟,弃穿透液!10!加0。3mL通用洗柱液到离心吸附柱中,12000-15000g室温离心半分钟,弃穿透液。
根据使用材料的不同进行下列操作:a)对贴壁细胞:吸尽培养液,在每10平方厘米细胞中加入0.8mL预热的溶液A,用枪充分吹打以确保细胞全部裂解,然后把裂解液转移到5mL塑料离心管中。b)对悬浮细胞:离心收集细胞,吸尽液体,在每1-5×106悬浮细胞中加入0。8mL预热的溶液A,用枪充分吹打以确保细胞全部裂解。然后把裂解液转移到5mL塑料离心管中!如果是fibroblasts或carcinoma细胞,0!
DNA提取试剂
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提取DNA想简单点很好办,购买商业化的试剂盒就行了,柱式的植物组DNA提取试剂盒,QIAGEN或者TIANGEN或者上海华舜,这些公司都有卖的,比传统的酚提取快速简单多了。
测序的话,ABI公司有专门的测序试剂盒(BIGDYE),说明书很详细,操作过程很简单,加入BIGDYE MIX做个测序反应(PCR)就ok了